Fichier PCRquantitative.doc
Personne référente : Laurence Lejay
Préparation (au labo)
LC préMix
Des tubes de réactifs 1a et 1b sont stockés dans le tiroir à enzyme à -20°C. Le LC préMix (213 µl) est obtenu en mélangeant 1 tube neuf de réactif 1a (23.3 µl) avec 1 tube neuf de réactif 1b (190 µl). Stocker à l’abri de la lumière à 4°C < 2 semaines.
Amorces
Les oligos sont en solution à 10 µM.
Mix réactionnel (peut être conservé < 2 semaines à l’abri de la lumière à 4°C)
| LC prémix | 2 | 18 | 34 | 52 | 68 | 136 | 200 |
| amorce 1 | 0.5 | 4.5 | 8.5 | 13 | 17 | 34 | 50 |
| amorce 2 | 0.5 | 4.5 | 8.5 | 13 | 17 | 34 | 50 |
| H2O | 6 | 54 | 102 | 156 | 204 | 408 | 600 |
| total | 9 | 81 | 153 | 234 | 306 | 612 | 900 |
Réaction (à proximité de l’appareil)
1. Allumer le light cycler, puis l’ordinateur
Ouvrir le logiciel light cycler. Cliquer sur RUN. Le logiciel demande de faire un self test; si c’est la première utilisation de la journée, cliquer OK (après avoir enlevé le carrousel; lors du test la paillasse doit rester immobile).
Le carrousel étant enlevé, cliquer sur open experimental file, puis sur PRECHAUFFAGE. Lorsque le logiciel demande le nombre de capillaires, répondre 1.
2. Déposer dans les capillaires, sur un portoir froid, avec des cônes effilés (1 carrousel contient 32 capillaires max) :
-1 µl ADNc (produit de la réaction de RT-PCR)
-9 µl de Mix réactionnel
3. Disposer les capillaires dans le carrousel du light cycler; bien enfoncer les capillaires sans forcer (en cas de blocage nettoyer la loge du capillaire avec une petite brosse prévue à cet effet).
4. Mettre le carrousel dans son adaptateur (carrousel à la verticale, sigle Roche vers le haut). Centrifuger (15 sec à 3 000 rpm; la centrifugeuse est programmée).
Mettre le carrousel (sans l’adaptateur) dans le light cycler (selon l’encoche). Appuyer sur le carrousel (=> « clac »). Fermer le couvercle du light cycler.
5. Cliquer sur open experimental file, puis sur le programme TEST PRIMER. Cliquer sur RUN. Indiquer le nombre et les noms des échantillons à l’ordinateur (rq : on peut lancer le run et nommer les échantillons plus tard).
Les conditions de pCR sont :
| 95°C 10 min | |||
| 95°C 5s |  |
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| 62°C 7s | 45x | ||
| 72°C 8s | |||
| 95°C 10s | |||
| 73°C 30s | |||
| melting curve (73°C à 95°C pente de température de 0.05°C par seconde) | |||
| refroidissement à 40°C 10 min | |||