Fichier ProtoCellGarde.doc
Personne référente : Anne-Aliénor Véry
Les protoplastes sont préparés à partir de feuilles de rosettes de plantes âgées de 20 à 25 jours ayant poussé en chambre de culture jours courts. Seules les feuilles des plantes saines sont utilisées, une plante ayant subit un stress physique (broutage par des insectes, feuille cassée) modifie la composition de sa paroi et les protoplastes deviennent très difficiles à patcher.
Détacher à la pincette des fragments d’épiderme puis répartir dans 2 tubes Eppendorf contenant chacun 1 ml d’une solution de digestion de la paroi cellulaire.
La digestion est effectuée dans un bain-Marie agité à 27°C pendant 40 min.
Les protoplastes (cellules épidermiques, cellules du mésophylle et cellules de garde) sont séparés des tissus non digérés par passage sur un filtre de 50 µm.
Cinq volumes (i.e., 5 mL par mL de solution de digestion) de solution de bain sont versés sur le filtre afin d’entraîner les protoplastes et de diluer rapidement les enzymes de digestion. (la solution de bain permet de fixer la pipette de patch aux cellules).
La suspension de protoplastes est alors répartie dans des tubes Eppendorf placés dans de la glace.
Après 15 minutes permettant la sédimentation des protoplastes, le surnageant est remplacé par de la solution de bain fraîche, de façon à éliminer totalement les enzymes de digestion.
Les protoplastes sont conservés dans de la glace, et utilisés pour les enregistrements électrophysiologiques dans les 10 heures qui suivent. Les protoplastes de cellules de garde sont aisément identifiables parmi les autres protoplastes grâce à leur morphologie (petite taille et petits chloroplastes).
Solution de digestion :
| CaCl2 | 1 mM |
| Acide ascorbique | 2 mM |
| Cellulase (Onosuka, type RS, Japon) | 1% (masse/vol) |
| Pectolyase (Seishin Pharmaceutical, type Y23, Japon) | 0.1% (masse/vol) |
| MES-KOH pH 5.5 | 1 mM |
L’osmolarité de cette solution est ajustée à 460 mM avec du mannitol
Solution de bain :
| CaCl2 | 10 mM |
| K-glutamate | 100 mM |
| MgCl2 | 2 mM |
| MES-KOH pH 5.5 | 10 mM |
L’osmolarité est ajustée à 500 mM avec du mannitol