Fichier SelectionTransformants.doc
Personne référente : Angélique Adiveze
Date : mars 2011
Version précédente : v1
Après avoir transformé le pied mère par trempage des inflorescences, on procède à la récolte des graines T1.
Parmi ces graines, certaines donneront des plantes mutantes transformées.
Pour les identifier, on les sème, sur un milieu sélectif contenant l’antibiotique de résistance ou l’herbicide correspondant au gène de résistance porté par le vecteur binaire.
1. Sélection de transformants sur antibiotique (kanamycine, hygromycine)
Après stérilisation, on sème les graines in vitro sur milieu sélectif contenant l’antibiotique.
Stérilisation des graines :
Solution de stérilisation : 0.2g de Bayroclore dissout dans 32ml d’eau et 32ml d’éthanol technique (dissoudre d’abord dans l’eau avant d’ajouter l’alcool). Remplir de graines le fond d’un microtube de 1.5ml, y verser 1ml de solution de stérilisation puis mettre sous agitation pendant 30mn maximum.
Sous la hotte, ôter le liquide, puis faire 3 rinçages à l’éthanol, on doit enlever le maximum de liquide au dernier rinçage. Laisser sécher sous la hotte pendant quelques heures avant de semer sur boites de pétri.
Les antibiotiques de sélections sont, en général, la kanamycine ou l’hygromycine.
Concentrations :
– kanamycine : 50µg/ml
– hygromycine : 30µg/ml
Faire des stocks concentrés 1000x, stériliser sur filtre 0.2µm et aliquoter dans des eppendorfs de 1.5ml. Les conserver à -20°C.
Afin de mieux apprécier la résistance , il est conseillé de semer, en parallèle des graines témoins (WT) ; un eppendorf de graines issues de plantes résistantes à l’antibiotique correspondant et un eppendorf de graines issues de plantes sauvages.
Les stériliser en même temps que les graines T1 d’intérêt.
Couler des boites de pétri avec du milieu MS/2 (2.2g/l Murashige et Skoog + 7g/l agar, pH 5.7-5.8 avec KOH) et contenant l’antibiotique de résistance (1ml pour 1 litre, juste avant de couler les boites).
Lorsque les boites sont solides, semer les graines stériles, sous la hotte (1 tube / boite).
Après avoir fermé les boites avec du parafilm, les mettre dans une chambre de culture réservée à cet usage (T° de 20 à 25°C)
Seules les plantes résistantes survivront.
Repiquer les transformants en serre, sur terreau, environ 15 j après le début de la mise en sélection.
Environ 6 semaines plus tard, on récolte les graines T2.
2. Sélection de transformants sur herbicide (Basta)
La sélection s’effectue sur terreau.
Semer à la volée quelques graines non stériles sur terreau, en serre.
Arroser par sub- irrigation. Recouvrir les barquettes avec une plaque de verre pour faciliter la levée.
Une semaine après, lorsque les cotylédons sont sortis, pulvériser avec du basta dilué au 500ème (2ml/l, donc 312mg/l de glufosinate d’ammonium).
En parallèle continuer l’arrosage par sub-irrigation.
Réitérer l’opération tous les 3 à 4 jours.
Dès la seconde pulvérisation on distingue les plantes résistantes, les autres jaunissent.
On peut repiquer les transformants dans des pots individuels quelques jours après la 3ème pulvérisation.