Fichier voltage-clamp.doc
Personnes référentes : Benoît Lacombe, Bertrand Moreau, Jean-Baptiste Thibaud, Anne-Aliénor Véry et Sabine Zimmermann
Porter des gants lors de la manipulation des xénopes.
Veiller à la stabilité de la bouteille de gaz utilisée pour l’injection des ovocytes.
Risques de brûlure avec les pipettes venant d’être étirées. Utiliser des pinces pour les sortir des mandrins de l’étireuse.
Risques chimiques éventuels avec les inhibiteurs.

1- Préparation des ovocytes de xénope
Un xénope est anesthésié par refroidissement (sous de la glace pilée) pendant 20 min et opéré sur un lit de glace pilée.
– Inciser au bas de l’abdomen la peau puis le muscle sous-jacent pour atteindre directement les ovaires de l’animal.
– Prélever un ou deux lobes ovariens et les placer dans une solution OR2.
(Le muscle et la peau sont recousus chacun à l’aide de 3 points de suture avec du fil résorbable (Ref). Rincer la plaie avec du ringer stérile avant et pendant la suture).
– Traiter à la collagénase (type IA, Sigma; 1 mg.mL-1 dans OR2) pendant 1 H sous agitation à 19°C pour individualiser les ovocytes
– Rincer les ovocytes avec OR2 avant de les trier (sous loupe)
– Conserver les ovocytes dans du milieu ND 96
– Immédiatement après le tri ou le lendemain, les ovocytes subissent une injection d’eau ou de solution d’ARNc de concentration variable (2 à 2000 µg.mL-1,)
– Aspirer la solution à injecter dans la pointe d’une micropipette (diamètre de pointe 10-15 µm) montée sur un micromanipulateur mécanique (Narishige, Japon) et injecter 50 nL de cette solution dans chaque ovocyte à l’aide d’un injecteur pneumatique, sous loupe binoculaire (x40, Olympus).
– Les ovocytes injectés peuvent être maintenus en vie une semaine à 19°C dans le milieu ND96. Le milieu est renouvelé quotidiennement et les ovocytes endommagés sont éliminés

Ajuster le pH à 7,5 avec NaOH 1M puis autoclaver

50 µg.mL-1 de gentamicine (Sigma).

2-Electrophysiologie (voltage-clamp à 2 électrodes)

Les mesures sont effectuées 1 à 2 jours après injection.

Dispositif :
Les électrodes de potentiel et de courant sont étirées (étireuse Narishige PP-83, Japon) à partir de capillaires de verre (Micro-hématocrites, Modulohm, Dannemark) et sont remplies de KCl 1M.
L’électrode de référence, placée en aval de l’ovocyte, est reliée à la solution de percolation par un pont gélosé (1%) contenant du KCl 1M.
Une microélectrode de référence locale est également utilisée. Elle permet une mesure plus précise de la différence de potentiel de part et d’autre de la membrane, des chutes de potentiel ayant lieu entre la surface de l’ovocyte et l’électrode macroscopique de référence. L’électromètre utilisé est un Axoclamp 2A (Axon Instruments Inc., U.S.A.). Le programme pCLAMP (Axon Instruments Inc., U.S.A) exécuté sur un microordinateur interfacé avec l’électromètre permet d’imposer le potentiel de membrane, l’acquisition des données et leur analyse.

Mesures :
Placer l’ovocyte dans une cuve de volume 200 µL dans laquelle percole la solution expérimentale à la vitesse de 1 mL.min-1 durant toute la durée de l’expérience.
Les différentes solutions contiennent MgCl2 6 mM, CaCl2 1,8 mM, MES ou Hepes 10 mM, pH 5,5 à 7,5 (BTP ou Tris) et sont complémentées par des concentrations variables (jusqu’à 100 mM) de potassium (K-glutamate ou KCl) et ou sodium (Na-glutamate ou NaCl) si on travaille avec des systèmes de transport de K+ ou Ca2+.
Des inhibiteurs de canaux ou de régulateurs de canaux peuvent être éventuellement ajoutés (e.g., Cs+ (max 100 mM), Ba2+ (max 100 mM), TEA, Gd2+ (5 mM), exceptionnellement toxines extraites de venins, inhibiteurs de phosphatases …). La cuve, les micromanipulateurs et la loupe binoculaire se trouvent à l’intérieur d’une cage de Faraday. Toutes les expériences sont réalisées à température ambiante.

Risques :
Sanitaire : la maladie la plus souvent rencontrée dans notre élevage est la maladie dite des « red legs » liée au sur-développement d’une bactérie de type aéromonas endogène. Attention une transmission à l’homme n’est pas exclue. Il est préférable de se protéger les mains avec des gants lors de la manipulation des xénopes.
Autres risques : une bouteille de gaz (N2) est utilisée pour l’injection des ovocytes. Veiller à ce qu’elle ne puisse pas tomber.
Risques de brûlure avec les pipettes venant d’être étirées. Utiliser des pinces pour les sortir des mandrins de l’étireuse.
Risques chimiques éventuels avec les inhibiteurs.