COStransfection.doc
Personnes référentes : Benoît Lacombe, Bertrand Moreau, Jean-Baptiste Thibaud, Anne-Aliénor Véry et Sabine Zimmermann

Culture
– cellules dans Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) + 10% fetal bovine serum
– « passage » dissociation & distribution par rinçage avec PBS (sans Ca, sans Mg) + incubation 2-3 min avec trypsin-EDTA

Transfection par Fugene6
– mettre 3 µl de fugene6 dans 97 µl de DMEM SANS serum
– attendre 5 minutes
– mettre 1 µl d’ADN (gene d’interêt + gene de marquage pIRES-CD8)
– tapoter légèrement le tube pour mélanger
– attendre au minimum 15 minutes
– verser la solution DMEM+Fugene6+ADN directement sur les cellules COS (100 µl par boite de 3.5 mm – les cellules doivent avoir été dissociées entre 4 heures et 12 heures avant, et être entre 50% et 80% de confluence, elles doivent être dans du milieu DMEM+serum)
– la veille de l’experimentation (J+2 a J+4) dissociation de cellules par trypsine
– distribution dans de nouvelles boites (2 ml DMEM + serum) avec une densité faible
– marquage & patch-clamp dans les 48 heures qui suivent

Marquage par dynabeads CD8 (Dynal Biotech)
Il suffit de mettre 1 microlitre de dynabeads directement sur les cellules COS transfectées dans le milieu DMEM.
Agitation doucement 2-3 minutes, et rinçage 2-3 fois avec la solution externe de patch.

Patch-clamp
– pipettes à tirer …
– solutions de base:
o   pipette: 150 mM KCl, 3 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2 (KOH)
o   bath in: 150 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1.5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4 (NaOH)
o   bath out: 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4 (NaOH)
o   … à suivre … variations de concentration en K+ etc…
– après obtention de « Gigaseals » (= contact entre pipette & membrane de cellule) application de protocoles de voltages imposés pour enregistrer les courants traversant le membrane