Fichier GUSFLUObilles.doc
Personne référente : Marc Lepetit
Date : Juin 2004
Origine : Thomas Girin et Marc Lepetit

Réservation du Victor sur calendar.yahoo.com
Yahoo! ID : bpmpvictor
Password : victor.

Substrat : MUG=4-Methyl-Umbelliferyl β-D-Glucuronide
Produit de la réaction : MU=Methyl-Umbelliferone

Tampon d’extraction (GEB):
(Pour 500 ml)
50 mM NaPO4, pH 7   (14.4 ml Na2HPO4 1M, 10.6 ml NaH2PO4 1M)
5 mM DTT (0.38 g)
1 mM Na2EDTA (0.19 g)
0.1% sodium lauryl sarcosyl (0.5 g)
0.1% Triton X-100 (0.5 ml)
conserver à 4°C < mois

MUGX2 (=2 mM) (préparer ex tempo, mettre à l’abri de fortes lumières).
Pour une plaque de 96 puits (100 réactions), dissoudre 10.57 mg dans 15 ml de GEB

1. Les tissus sont pesés, récoltés dans des microtubes de 2 ml. Puis congelés avec une bille d’acier dans l’azote liquide.

EXTRACTION

2. Les tissus sont broyés au broyeur à billes (pièce 173). Les 2 portoirs Quiagen en téflon blanc (24 places) sont au congélateur -50°C (pièce 167). . Préparer des feuilles de papier 3MM découpées à la taille (80x122mm) pour caler les tubes dans le portoir au dessus et en dessous (évite de casser les tubes).
– Sortir les portoirs du congélateur. Mettre les tubes dans les 2 portoirs (équilibrer les portoirs).
– Mettre les feuilles de papier en haut et en bas pour caler les tubes avec les couvercles.
– Placer les 2 portoirs sur les 2 bras. Régler 1 minute 30 sec, 25 secousses/seconde. Broyer.
– Remettre les tubes dans l’azote liquide et les portoirs à -80°C. Attention vérifier que les tubes ne sont pas cassés (si casse, transférer dans un nouveau tube juste après le rajout du tampon d’extraction).
– Attendre 5 à 10 minutes que les portoirs refroidissent au congélateur pour effectuer un nouveau broyage.

3. L’extrait brut est réalisé dans les microtubes de 2 ml avec la bille. 800 µl de tampon d’extraction est ajouté. Pour diminuer la fluorescence endogène, on ajoute une pointe de spatule de Polyclar AT (PVP insoluble). Les échantillons sont placés sur l’agitateur à microtubes 5 minutes à température ambiante.

4. Clarifier l’extrait par centrifugation 10 minutes à 13000 rpm.

5. Le surnageant est filtré sur un tampon de laine de verre placé à l’extrémité d’un cône de P1000. Le surnageant est récolté sur une plaque masterblock 96 puits mise sur de la glace.

CINETIQUE

6. La cinétique enzymatique est réalisée dans des microplaques 96 puits noires au Victor (fluorimètre). La cinétique enzymatique est faite sur 150 µl d’extrait brut pipeter à la pipette multicanaux (diluer éventuellement dans du GEB suivant l’activité de l’échantillon). Mettre aussi une gamme étalon de MU (le produit de la réaction): prendre 150 µl de solutions à 300, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 10, 1, 0.5, 0.1, 0 µM de MU dans du GEB (conservée à -20°C).

7. Si le Victor et l’ordinateur sont éteints, mettre en marche le Victor, puis mettre en marche l’ordinateur.
Sur le bureau de l’ordinateur, cliquer sur « Victor ».
Une fenêtre « Wallac manager » s’affiche. Cliquer sur température « ON ». Régler la température d’incubation à 37°C. cliquer sur « Apply ». La température est affichée en bas à droite. Cliquer sur le 2ème onglet en haut à gauche « start run/define plate map ». Une fenêtre avec un gugusse s’affiche, cliquez sur « Suivant ».
Une fenêtre « select protocol » s’affiche. Choisir le protocole Intégration/Thomas/TG_GUS (355/460 1s) (excitation=365nm, émission=455nm, 2 min agitation puis lecture toutes les 10 minutes). Cliquer sur « suivant ».
Une fenêtre « specify number of plate » s’affiche avec le plan d’une plaque. Tout sélectionner (tout est bleu), puis cliquer sur « measured ». cliquez sur « Suivant ».
Une fenêtre « commentaires » s’affiche, recliquez sur « Suivant ».
Une dernière fenêtre s’affiche avec « terminer ». A ce stade attendre de lancer la réaction enzymatique.

8. La réaction est démarrée en ajoutant, à la pipette multicanaux 150 µl de substrat (MUGX2) dans chaque puit. La plaque est placée dans le Victor.
Cliquer sur « terminer ». La plaque est « avalée » par le victor et le programme réactionnel démarre.

9. Lorsque c’est fini cliquer sur « latest assay run », puis « file export » et sauver sur une disquette (fichier excel)