Fichier ExtractARNGuanidine.doc
Personne référente : Laurence Lejay
Date : Février 2008
Points importants :
Produits chimiques utilisés :
– Guanidine
– MES
– EDTA
– béta mercaptoéthanol
– Phénol
– Chloroforme
– Alcool isoamylique
– Acétate de Sodium
– Isopropanol
– Chlorure de Lithium
– éthanol
– DEPC
Manipuler avec des gants et une blouse
Tampon d’extraction :
3 ml de tampon d’extraction par g de matière végétale broyée :
Peser si possible le thiocyanate de guanidine sous hotte de pesée, ajouter le béta mercaptoéthanol sous sorbonne
| 25 ml | 50 ml | 75 ml | 100 ml | |
|---|---|---|---|---|
| Guanidine | 19.1 g | 38.2 g | 57.3 g | 76.4 g |
| MES 0.5 M | 1 ml | 2 ml | 3 ml | 4 ml |
| EDTA 0.2 M | 2.5 ml | 5 ml | 7.5 ml | 10 ml |
| béta mercaptoéthanol | 98.3 µl | 178.6 µl | 267 µl | 358 µl |
| H2O | 7 ml | 13.5 ml | 20.5 ml | 27 ml |
Ajuster à pH 7 (2 ou trois gouttes de NaOH 10N)
Chauffer un peu au four micro-ondes
– Préparer 4 tubes par échantillon (sous sorbonne) :
| 1) | Tampon d’extraction | 1 VOL |
| 2) | PCI | 1 VOL |
| 3) | Chlorof alcool isoam | 1 VOL |
| 4) | Vide | |
(attention les pipettes fondent pour 2 et 3)
– Mettre la centrifugeuse à refroidir (4°C)
– Tout nettoyer et avoir tout prêt avant d’aller chercher les échantillons dans N2 liquide
– Broyer au mortier dans N2 liquide et mettre la poudre encore glacée dans le tube 1 (sous sorbonne) pour que les RNAses n’aient pas le temps de se réchauffer. Agiter vigoureusement pour que la guanidine inhibe rapidement toutes les RNAses.
– Vortexer 5 min
– Centrifuger 15 min à 9000 rpm, 4°C
– tube 2 (sous sorbonne)
– Vortexer 5 min
– Centrifugation 20 min à 9000 rpm, 4°C
– tube 3 (sous sorbonne)
– Vortexer 5 min
– Centrifugation 20 min à 9000 rpm,4°C
– tube 4 (sous sorbonne)
– Précipiter les acides nucléiques par 1/10 Vol de Na Ac 3M (pH 4,8 traité DEPC) et 1 Vol d’isopropanol pendant 2 heures à -20 °C
– Centrifuger 30 min à 9000 rpm, 4°C
– Laver le culot avec 1 ml d’EtOH 70%
– Reprendre le culot dans un ml d’H2O et transférer dans des µtubes à vis
– Précipiter les ARN par 1/3 vol de LiCl traité au DEPC Overnight à 4°C
– Centrifuger 30 min à 9 000 rpm
– Laver le culot avec 1 ml d’EtOH 70%
– Centrifuger 30 min à vit max , 4°C et suspendre dans 50 µl d’H2O traitée DEPC