Fichier patch-clamp.doc
Personnes référentes : Benoît Lacombe, Bertrand Moreau, Jean-Baptiste Thibaud, Anne-Aliénor Véry et Sabine Zimmermann
La conductance membranaire des protoplastes est étudiée en enregistrant les courants transmembranaires par application de la technique du « patch-clamp » en configuration cellule entière (Hamill et al., 1981)
Electrodes de mesure (pipettes)
Les pipettes sont préparées à partir de capillaires en boro-sillicate de 10 cm de longueur et de 1.5 à 1.8 mm de diamètre (Kimax-51, Kimble Glass, Inc, Owens, IL) qui subissent un étirement horizontal contrôlé par une étireuse Sutter P-97 (Sutter Instruments Inc., Novato, CA) :
Le capillaire est centré au milieu d’un filament de tungstène à travers lequel circule un courant électrique (5 à 25 A).
Le filament chauffe et provoque la fusion partielle du verre. L’intensité du courant et la durée de son application sont contrôlées par un microprocesseur selon un programme défini par l’utilisateur.
Une force horizontale d’intensité et de durée variable est ensuite appliquée aux extrémités du capillaire afin de l’étirer.
Les pipettes utilisées pour les expériences sur protoplastes sont obtenues grâce à trois étirements successifs.
Obtention du scellement de la pipette à la cellule
Approcher la pipette de la membrane plasmique du protoplaste à l’aide d’un micromanipulateur.
Créer une dépression dans la pipette en appliquant une légère succion permettant l’adhésion de la membrane du protoplaste à l’électrode en verre. Une résistance de contact de plusieurs giga-ohms s’établit suite à cette succion. La qualité de ce scellement est évaluée en mesurant la résistance électrique du circuit de mesure (procédure offerte par l’amplificateur de patch-clamp, Axopatch 200A équipé d’une tête CV-201 A, Axon Instruments Inc., Foster City, CA).
Configuration cellule entière
La configuration obtenue après le scellement est appelée « cellule attachée ». Pour passer en configuration « cellule entière » permettant les enregistrements macroscopiques reflétant l’activité des canaux présents sur la totalité de la membrane plasmique, il faut rompre le patch de membrane situé à la pointe de la pipette. Pour cela on dispose de deux moyens, une succion brève et intense, ou une impulsion de courant.
En mode cellule entière, des courants capacitifs transitoires sont enregistrés lors d’un changement de polarisation membranaire. Ceux-ci sont dus au fait que la bicouche lipidique formant la membrane de la cellule agit comme un condensateur. Il faut les compenser en réglant le potentiomètre de la section « électrode capacitance compensation » situé sur l’amplificateur. Cette compensation est indispensable pour les expériences réalisées sur des cellules dont la surface membranaire est importante.
SOLUTIONS UTILISÉES POUR LES ENREGISTREMENTS
Solution de remplissage des pipettes
(milieu intracellulaire en configuration cellule entière) pour l’enregistrement de courants K+ :
| K-glutamate | 100 mM |
| MgCl2 | 2 mM |
| CaCl2 | 1 mM |
| EGTA | 5 mM (ajustement de la conc de calcium libre à 50 nM) |
| Mg-ATP | 2 mM |
| Hepes-KOH (pH 7,5) | 10 mM |
L’osmolarité est ajustée à 520 mOsmol avec du mannitol.
Le scellement de la pipette à la membrane cellulaire est réalisé dans une solution « de bain » riche en calcium. Le calcium permet de stabiliser les membranes lors du scellement. entière.
Solution de bain pour l’enregistrements de courants K+ des protoplastes de cellules de garde d’Arabidopsis :
| CaCl2 | 10 mM |
| K-glutamate | 100 mM |
| MgCl2 | 2 mM |
| MES-KOH (pH 5,5) | 10 mM |
L’osmolarité est ajustée à 500 mOsmol avec du mannitol
Solution de bain pour l’enregistrements de courants K+ des protoplastes de mésophylle de tabac :
| CaCl2 | 10 mM |
| K-glutamate | 50 mM |
| MgCl2 | 2 mM |
| MES-KOH (pH 5,5) | 10 mM |
L’osmolarité étant ajustée à 480 mOsmol avec du mannitol