qPCR – Q-PCR (Marc) | intranet IPSiM

Personne référente : Marc Lepetit
Date : Juin 2004
Origine : Philippe Nacry et Gabriel Krouk

Réservation de la machine
http://calendar.yahoo.com/
Yahoo! ID : bpmpqpcr
mot de passe : jossia

LC préMix

Des tubes de réactifs 1a et 1b sont stockés dans le tiroir à enzyme à -20°C. Le LCMix (213 µl) est obtenu en mélangeant 1 tube neuf de réactif 1a (23.3 µl) avec 1 tube neuf de réactif 1b (190 µl). Stocker à l’abri de la lumière à 4°C < 2 semaines

Amorces

Les oligos sont en solution à 10 µM

Mix réactionnel

LC prémix	2	4	8	12	16	20	24	28	32	36	40	44	48	52	56	60	64	68	136	200	268
amorce 1	.5	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	34	50	67
amorce 2	.5	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	34	50	67
H2O	6	12	24	36	48	60	72	84	96	108	120	132	144	156	168	180	192	204	408	600	804
total	9	18	36	54	72	90	108	126	144	162	180	198	216	234	252	270	288	306	612	900	1206

Le mix peut être conservé < 2 semaines à l’abri de la lumière à 4°C.

Faire un témoin négatif en remplaçant le cDNA par de l’eau
Faire une gamme en utilisant l’ échantillon dont le signal attendu est le plus fort ; dilution 1, 1/10, 1/100, 1/1000
Déposer dans les capillaires avec des cônes effilés (1 carrousel = 32 capillaires max)
   1 µl ADNc (produit de la réaction de RT-PCR)
   9 µl de Mix réactionnel
   Les capillaires peuvent être conservés quelques heures avant la réaction

Run

1. Disposer les capillaires dans le carrousel du light cycler SANS FORCER (en cas de blocage nettoyer la loge du capillaire avec une petite brosse prévue à cet effet). Mettre le carrousel avec les capillaires dans son adaptateur (sigle roche vers le haut). Centrifuger (la centrifugeuse est programmée).

2. Disposer le carrousel dans le light cycler (il y a une encoche)

3. Fermer le couvercle

4. Ouvrir le logiciel light cycler3. Cliquer sur RUN. Le logiciel demande de faire un self test, si c’est la première utilisation cliquer OK (lors du test la paillasse doit rester immobile).
Cliquer sur open experimental file-PROTOCOLE-MARC

Les conditions de pCR sont :

	10 minutes à 95°C
	95°C 5s
	62°C 7s		45x
	72°C 8s
	95°C 10s
	73°C 30s
	melting curve (73°C à 95°C pente de température de 0.05°C par seconde)
	refroidissement à 40°C 10 min

5. Cliquer sur EDIT SAMPLES
Indiquer le nombre d’échantillons
Cliquer sur DONE
Cliquer sur RUN
– pour les échantillons de gamme choisir « standart »
– pour le temoin négatif choisir « negative »
– pour les échantillons à analyser choisir « unknown ».
Cliquer sur DONE.
Une fenêtre de RUN s’affiche qui donne la fluo acquise au cours du temps.

Analyse des données

1. Data analysis-user-Admin-Data

Placer les cuseurs vert comme ça