qPR – Q-PCR (F’oise) | intranet IPSiM

Personne référente : Françoise Cellier
Date : 2006

Dnase treatment (RQ1 Rnase-Free Dnase, Promega)

A partir de 5µg d’ARN totaux
Remarque : si Dnase à partir de 2µg d’ARN, réaction dans 20µl final.

Dnase, par tube	ARN	5 µg
	RQ1 Dnase buffer 10X	5 µl
	RQ1 Dnase (1 U/µl)	1 U/µg d’ARN (5 µl)
	H2O	QSP 50 µl

Faire un mix quand plusieurs échantillons
1h 37°C
Ajouter 50 µl H2O
Phénol-Chloro
Chloro
Précipitation NaOAc/EthOH de 2h à ON à -20°C

Reverse transcription (M-MLV Reverse Transcriptase, Promega)

Centrifuger.
Rinçage EthOH 70% puis avec capillaire. Resuspendre les culots dans 18 µl H2O
Déposer 1 µl sur gel TAE 1% pour vérifier le dosage des ARN
Ajouter 1 µl d’Oligo(dT)15 primer à 05 µg/µl (Promega) au 17 µl restant
Incuber 10 min à 70°C (branlicoteur chauffant transport)
Centri bref et incuber dans la glace pendant 5 min

RT, par tube	M-MLV RT 5X buffer	5 µl
	dNTP 10 mM	2 µl
	M-MLV (200 U/µl)	1 µl

Faire un mix quand plusieurs échantillons
Ajouter les 8 µl du mélange réactionnel au 17 µl « d’ARN »
Mélanger délicatement à la pipette
Incuber environ 1h à 42°C
Inactiver la réaction 15 min à 70°C (~ facultatif)
Ajouter 25 µl H2O
Utiliser 1 µl par réaction de Q-PCR

Q-PCR

Préparer le LC pré-mix :
Les tubes de réactifs bouchon blanc et bouchon vert sont stockés dans le tiroir du haut du congélo à enzyme à -20°C.
Le LC préMix (213 µl) est obtenu en mélangeant 1 tube neuf de réactif bouchon vert (190 µl) avec 1 tube neuf de réactif bouchon blanc (23.3 µl). Stocker à l’abri de la lumière à 4°C < 2 semaines.

Par capillaire	LC pré-mix	2 µl
	Primer 1 (10 µM)	0,5 µl
	Primer 2 (10 µM)	0,5 µl
	H2O	6 µl
	RT	1 µl

Faire un mix (LC pré-mix, Primer 1, Primer 2, H2O) par couple de primers.
Gamme : Utiliser l’échantillon ou le signal attendu est le plus fort.
Utiliser la P20 pour tout les pipettages

A- dilution 1/5 (0,2)	Echantillon	10 µl
	H2O	40 µl

B- dilution 1/10 (0,1)	A	20 µl
	H2O	20 µl

C- dilution 1/50 (0,02)	B	10 µl
	H2O	40 µl

D- dilution 1/100 (0,01)	C	20 µl
	H2O	20 µl

Quand les capillaires sont remplis :
Dans la pièce Q-PCR : mettre les capillaires dans le carroussel (commencer par le n°1) ENFONCER LES CAPILLAIRES. Mettre la carroussel dans l’adaptateur ROCHE de la centri. Placer le tout dans la centri (inscription ROCHE vers le haut). Appuyer sur Start.
Ouvrir le logiciel light cycler3
Cliquer sur Run-Open experiment file-Protocole-Mathilde-exp
Le self test démarre si first use
Placer les capillaires dans la Q-PCR
Cliquer sur Edit samples-Indiquer le nombre de samples
Cliquer sur done
Cliquer sur run
Cliquer sur edit samples
Pour la gamme choisir standart
Pour les échantillons choisir unknown
Pour l’eau choisir negative
Cliquer sur done

Analyse des données (Light Cycler 3) :
Data analysis-user-Admin-Data-Foise-FQPx

Placer les cuseurs vert comme ça

Température-melting curve
Fermer la fenêtre

Placer les cuseurs vert comme ça

Cycle-quantification
Fit point

Step 2 : noise bande

Cliquer sur

Afficher 0,5

Step 3

Cliquer sur

Afficher 1

Pour sauver les datas : Quantification-export standard curve (sur clef USB)