Fichier ProtoTabac.doc
Personne référente : Carine Alcon
Origine : Geoffrey Duby
Solutions et milieux à préparer
Solution de digestion :
| CaCl2 | 5 mM |
| Saccharose | 0.5 M |
| BSA | 0.1% m/v |
| Macerozyme R-10 1 (Onozuka; Yakult Pharmaceutical) | 0.125% m/v |
| Cellulase R-10 (Onozuka; Yakult Pharmaceutical) | 0.2% m/v |
| MES-KOH (pH 5.2) | 5 mM |
Peser toutes les poudres, les mettre dans un bécher puis ajouter 50 ml d’H2O
Agiter environ 10 min, ajuster le pH entre 5.0 et 5.2 avec HCl 0.1 M et filtrer le milieu (filtre 0.2 µm)
Milieu de flotaison ML06 :
| CaCl2 | 15 mM |
| Saccharose | 0.6 M |
| MES-KOH pH 6.0 | 7.5 mM |
Tampon de lavage W5 :
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| Glucose | 5 mM |
| MES-KOH pH 5.6 | 1.5 mM |
Solution Mannitol/Mg :
| MgCl2 | 15 mM |
| Mannitol | 0.4 M |
| Mes-KOH pH 5.6 | 5 mM |
Solution de PEG :
| PEG 6000 | 25% m/v |
| mannitol | 0.4 M |
| Ca(NO3)2 100 mM | 100 mM |
Peser les poudres dans un pot «pipi» et ajouter l’H2O (en se servant d’un autre pot pipi qui contient 10 ml d’H2O pour ajuster le niveau nécessaire)
Ajouter déjà 1 goutte de KOH 0.1M et mettre à agiter le temps que l’on prépare les protos, puis ajuster le pH à 9
Filtrer avec filtre 0.2 µm
Milieu K3M :
| Volume pour une solution de 50ml | |
| macroéléments 10X | 5 ml |
| microéléments 1000X | 50 µl |
| Fe-EDTA 100X | 500 µl |
| MS Vitamine (Sigma ref M3900) 1000X | 100 µl |
| I.3.-Thiamine-HCl | 5 mg |
| Glucose 0.45M | 4.46 g |
| MES pH 5.7 (KOH), frais filtré avant utilisation 2.5 mM | 25 mg |
| FeEDTA 10 mM | 0.367 g pour 100 ml |
autoclavé
Microéléments:
| H3BO3 | 6.2 g/l |
| MnSO4, 4H2O | 22.3 g/l (1.69 g si .1H2O) |
| ZnSO4, 7H2O | 8.6 g/l |
| Na2MoO4, 2H2O | 0.25 g/l |
| CuSO4, 5H2O | 0.025 g/l |
| CoCl2, 6H2O | 0.025 g/l |
autoclavé
Macroéléments:
| NH4NO3 | 6 g/l |
| KNO3 | 19 g/l |
| CaCl2, 2H2O | 6 g/l |
| MgSO4, 7H2O | 3 g/l |
| KH2PO4 | 5 g/l |
| KCl | 3 g/l |
autoclavé
Abrasion des feuilles de tabac
A préparer en fin après-midi pour des observations au confocal
– Préparer 10 ml de milieu de digestion / boîte
– Sélectionner les feuilles de tabac
– Sélectionner de jeunes feuilles de plantes cultivées in vitro : feuilles saines entre 1 et 3 cm (mais on peut prendre une taille + grande) de couleur pas trop foncée et un peu molle (c.àd. un peu tombante)
– A Noter que parfois les feuilles trop jeunes ne digèrent pas bien
– Préparer 1 boîte de pétri ronde / transfo, 5 feuilles environ / boîte
– Penser à préparer tout le matériel (papier de verre avec un grain très fin, pinces, EtOH 70%, boîte de pétri pour poser le matériel stérile)
– Abraser les feuilles
L’abrasion se fait sous hotte stérile par du papier à poncer n°1200 (grain très fin).
Coincer 1 feuille entre ses doigts, face inférieure au dessus.
Frotter la feuille avec le papier de verre pour abraser toute la surface
Poser la feuille à plat dans la boîte contenant 10 ml de milieu, face abrasée en contact avec le milieu (la feuille doit être translucide)
Laisser incuber O/N dans la chambre de culture in vitro à 25°C dans le noir (sous un carton)
Préparation des protoplastes
Après digestion, Agiter doucement les boîtes de petri pour libérer les protoplastes
– Filter la solution contenant les protoplastes :
Poser sur un costar de 13 ml un morceau de miracloth plié en 4 (organiser le filtre en entonnoir à l’aide de la pince stérile)
Pipetter les protoplastes avec pipette de 25 ml et déposer doucement la solution sur le miracloth (garder le même morceau de miracloth pour 2 ou 4 boîtes), 1 costar / boîte
Dans chaque costar ajouter 4 ml de miieu MLO6
– Centrifuger à température ambiante (~19°C), 9 min à 100 g (centri eppendorf 5810R)
– Prélever la phase > (~3 mm) contenant les protoplastes avec 1 pipette de 10 ml
-On pipette également la phase d’en dessous , c’est à dire entre 4 et 6 ml
– On poole les zones de flottaison de 2 costars (de 13 ml) dans un costar de 50 ml
– Ajouter du milieu W5 jusqu’à ce que volume = 40 ml il faut diluer 3 à 5 fois)
– Centrifuger à température ambiante (~19°C), 9 min à 100 g (centri eppendorf 5810R)
Jeter le surnageant et ajouter 40 ml de Mannitol-Mg
(ajouter le milieu doucement en versant sur la paroi du tube à l’aide d’une pipette) et mettre le culot en suspension en agitant doucement le tube
– Centrifuger à température ambiante (~19°C), 9 min à 100 g (centri eppendorf 5810R)
– Jeter le surnageant et ajouter 20 ml de Mannitol-Mg (ajouter le milieu doucement en versant sur la paroi du tube à l’aide d’une pipette)
– Centrifuger à température ambiante (~19°C), 9 min à 100 g (centri eppendorf 5810R)
– Jeter le surnageant et ajouter du mannitol-Mg en fonction de la taille du culot en sachant qu’il faut 150 µl / transfo
Je rajoute entre 300 et 500 µl par costar
Laisser les protos à RT
Transformation des protoplastes
Dans un tube Bactério (cristal) ajouter :
5 à 10 µg de plasmide (prep Nucleobond qui ne doit pas dépasser 1 mois)
100 à 150 µl de protoplastes
150 µl de PEG
– Laisser 30 min à température ambiante à l’obscurité sous la hotte
Ajouter 8 ml de K3M préparé au dernier moment (déposer sur la paroi du tube goutte à goutte, à savoir qu’il faut 11 ml / transfo)
milieu K3M protoplastes Tabac (Negrutiu et al., 1992)
| macroéléments 10 X | g/l | 200 ml |
| NH4NO3 | 6 | 1.2 |
| KNO3 | 19 | 3.8 |
| CaCl2, 2H2O | 6 | 1.2 |
| MgSO4,7 H2O | 3 | 0.6 |
| KH2PO4 | 5 | 0.34 |
| KCl | 3 | 0.6 |
autoclavé
– Centrifuger à température ambiante (~19°C), 7 à 9 min à 100 g (centri eppendorf 5810R)
– Jeter le surnageant et ajouter 3 ml de KM
– Mettre à incuber à ~19°C en inclinant le tube (dans le frigo où sont stockés les ovocytes) pendant 12 H