Fichier ProtoArabido.doc
Personne référente : Carine Alcon
Composition des solutions :
voir milieu « JPL » en annexe
JPL 0,34M Glucose Mannitol
milieu JPL sans saccharose
30,5 g/l Glucose
30,5 g/l Mannitol
pH 5,5 avec KOH
JPL 0,28M saccharose
milieu JPL
96 g/l de Saccharose
pH 5,5 avec KOH
Ca(NO3)2 0,275 M
64,94 g/l Ca(NO3)2 , 4H2O
Solution PEG
25% PEG 6000
0,45 M Mannitol
0,1 M Ca(NO3)2
Laisser agiter O/N
Puis ajuster à pH 9 avec KOH
Solution enzymatique
1% Cellulase RS (Yakult)
0,2% Macerozyme R10 (Yakult)
dans JPL 0,34 M Glucose-Mannitol
Agiter doucement 30 min environ.
Préparer au dernier moment.
1. Entretien de la culture cellulaire à 10% dans le milieu JPL. Repiquage 1 fois par semaine.
2. Pour la préparation des protoplastes, repiquer les cellules à 33% dans 40 ml de milieu JPL et mettre en culture pendant 2 à 5 jours (l’ideal est une culture de 3 jours).
3. Centrifuger la culture cellulaire à 1500 rpm dans un falcon de 50 ml, 5 min. Ne pas utiliser le frein ou le mettre très bas.
4. Jeter le surnageant, ajouter 25 ml de la solution enzymatique, compléter jusqu’à 50 ml avec du milieu JPL 0,34 M glucose / mannitol. Resuspendre le culot et verser les 50 ml dans un nouveau Erlen.
5. Ajouter 25 ml de milieu JPL 0,34 M glusose/mannitol.
6. Mettre à agiter 3 à 4 heures.
7. Vérifier que la paroi des cellules a été bien digérée.
Toutes les centrifugations sont réalisées dans la centri Beckmann GPR. Les centrifugations sont effectuées sans frein.
8. Transférer les cellules dans 2 falcons de 50 ml. Centrifuger 5 min à 1500 rpm.
9. Jeter le surnageant. Ajouter 25 ml de milieu JPL 0,34M glucose-/-mannitol.
10. Centrifuger 5 min à 1000 rpm.
11. Jeter le surnageant. Ajouter 5 ml de milieu JPL 0,28M saccharose. Pooler les 2 tubes dans un falcon de 13 ml.
12. Centrifuger 5 min à 800 ou 600 rpm (sans frein).
13. Récupérer les protoplastes qui flottent.
Transformation des protoplastes
14. Dans chaque tube
– ajouter 5 µg de chaque plasmide (15 µg max) dans 15 µl d’H2O
– 2 à 4.105 proto dans 50 µl, mélanger doucement
– 150 µl de PEG. Mélanger doucement en agitant le tube.
15. Incuber 15 à 30 min. à temp ambiante à l’obscurité.
16. Laver le PEG par addition de 500 µl de Ca(NO3)2. Mélanger doucement en agitant le tube. Ajouter à nouveau 500 µl de Ca(NO3)2. Mélanger doucement en agitant le tube.
17. Centrifuger 5 à 7 min. à 600-800 rpm
18. Enlever le surnageant avec une pipette pasteur.
19. Reprendre le culot avec 500 µl de JPL 0,34M Glucose-Mannitol.
Mettre les tubes à l’obscurité en position couchée.
Annexe :
| Concentré 10X | 1 pot de 200ml | 2 pots de 200 ml | |
| KH2PO4 17g/l | 6 ml | 12 ml | Sol. à 4°C |
| Saccharose | 30 g | 60 g | |
| Tp PO4 A | 390 µl | 780 µl | Sol. à 4°C |
| Tp PO4 B | 610 µl | 1.22 ml | Sol. à 4°C |
| H2O | qsp 2 litres | qsp 4 litres |
Tampons PO4 0.2 M :
A : NaH2PO4, 1 H2O 5.52 g pour 200 ml conserver à 4°C
B : Na2HPO4, 12 H2O 14.34 g pour 200 ml conserver à 4°C
Solution KH2PO4 : 17 g pour 1000 ml conserver à 4°C
Dissoudre le saccharose dans le tampon ci-dessus.
Mesurer le pH et ajuster si nécessaire à pH 5.7 et autoclaver.
Concentré 10X pour milieu de culture de cellules :
| Volume du concentré | 1 litre | 3 litres | 4 litres | 5 litres | 6 litres | Rq |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Macroéléments (g) | ||||||
| KNO3 | 19.65 | 58.95 | 78.60 | 98.25 | 117.90 | |
| CaCl2, 2H2O | 1.32 | 3.96 | 5.28 | 6.60 | 7.92 | |
| MgSO4, 7H2O | 1.11 | 3.33 | 4.44 | 5.55 | 6.66 | |
| Solution E (ml) | 10 | 30 | 40 | 50 | 60 | 4°C |
| Microéléments (ml) | 3 | 9 | 12 | 15 | 18 | 4°C |
| Hydrolysat caséine (g) | 1 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Myo-Inositol (g) | 1 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Glycine (mg) | 20 | 60 | 80 | 100 | 120 | |
| Vitamines (ml) | 10 | 30 | 40 | 50 | 60 | -20°C |
| Hormones (ml) | ||||||
| ANA | 2 | 6 | 8 | 10 | 12 | -20°C |
| Repartir par pot de 200 ml de concentré 10X | conserver à -20°C | ||
| Solution E (10mM) : | FeSO4, 7H2O : | 2.78 g | |
| Na2EDTA : | 3.72 g | ||
| H2O qsp 1000 ml | conserver à 4°C | ||
Microéléments :
| H3BO3 | 3,10 g |
| MnSO4, 4H2O ou MnSO4, 1H2O | 11,15 g ou 8,45 g |
| ZnSO4, 7H2O | 5,29 g |
| KI | 410 mg |
| Na2MoO4, 2H2O | 125 mg |
| CoCl2, 6H2O | 12,5 mg |
| CuSO4, 5H20 | 12,5 mg |
| H2O qsp | 500 ml |
Ne pas congeler, autoclaver et conserver à 4°C
Vitamines :
| Thiamine HCl (# P3902) | 40 mg |
| Ac. Nicotinique (# N0765) | 50 mg |
| Pyridoxine HCl (# P8666) | 50 mg |
| H2O qsp | 100 ml |
Conserver à -20°C.
Hormones :
| ANA (# N0640) | 100 mg |
| H2O qsp | 100 ml |
Dissoudre l’ANA dans 1 ml NaOH 0,5 N et conserver à -20°C.