Fichier PrepBactThermo.doc

Personne référente :

la veille :
– Inoculer une pré-culture dans 3 ml de mileu LB à partir d’une colonie isolée sur boîte de Pétri
– Préparer et metttre au froid :
0.1 M MgCl2 stérile
0.1 m CaCl2, 15% glycérol

Jour J :
– Inoculer 2X 50 ml de milieu LB contenant 1% glucose et 1 mM MgSO4 (facultatif) par 2X 250 µl de préculture.
– Incuber à 37°C, sous agitation (incubateur bactéries) jusqu’en phase exponentielle de croissance (2h45 à 3h pour DO de 0.3)
– Lorsque la DO est de 0.3, mettre à refroidir ½ h dans la glace
– Transférer dans un tube Falcon
Toutes les étapes suivantes doivent être réalisées dans la glace entre chaque centrifugation ou en chambre froide
– Centrifuger dans une centri réfrigérée 4°C, 4000 rpm, 15 min
– Élimner le surnageant (renverser le tube pour éliminer tout le milieu)
– Remettre le culot en suspension dans la moitié du volume original dans 0.1 M MgCl2 refroidi à 4°C (25 ml)
– Laisser 10 min dans la glace
– Centrifuger dans une centri réfrigérée 4°C, 4000 rpm, 15 min
– Remettre le culot en suspension dans la moitié du volume dans 0.1 M CaCl2, 15% glycérol (12 ml)
– Laisser dans la glace 30 min à 1 h
– Centrifuger dans une centri réfrigérée 4°C, 4000 rpm, 15 min
– Remettre le culot en suspension dans 1/10 à 1/20 de 0.1 M CaCl2, 15% glycérol (2.5 à 5 ml)
– Aliquoter par 200 µl et congeler immédiatement dans l’azote liquide
– Stocker à -80°C