qPCR – De la plante à la Q-PCR

Personne référente : Marc Lepetit
Date : Avril 2004
Origine : Philippe Nacry, Thomas Girin et Gabriel Krouk

Mini Extraction des ARNs

(Thomas et Marc, d’après Philippe Nacry, Avril 2004)

Cette méthode permet d’obtenir des rendements compris entre 0.75 et 2 µg d’ARN par mg de matière fraîche.

Attention, les ARN sont très sensibles aux RNAses. Manipuler avec des gants et de préférence du matériel jetable. Produits chimiques, pipettes, solutions RNase free.

Réactifs nécessaires :
   TRIzol
   Chloroforme / alcool isoamylique (24/1)
   Glycogène (entraîne l’ARN)
   Ethanol 75% dans H2O DNase free (conservé à -20°C jusqu’à utilisation)
   Isopropanol
   ddH2O (DNase/RNAse free H2O milliQ autoclavée)

Avant utilisation les billes d’acier sont lavées dans l’éthanol absolu, puis dans de l’eau en présence de détergent, puis lavés 3 fois à l’eau milliQ et enfin rincés dans l’éthanol absolu avant d’être séchées dans le four pasteur.
Les centrifugations sont faites sur une centri Eppendorf 5 810 R, avec un rotor F-45-30-11. 14000 rpm et 12000 rpm correspondent respectivement à 20817 g et 15294 g.
Les tissus (racines ou feuilles de environ 300 plantes cultivées 8 jours en boîtes de pétri verticales ; quelques dizaines de mg MF) sont prélevés dans des tubes eppendorfs 2 ml, congelés dans l’azote liquide et stockés à -80°C.

Protocole :
1. Broyage au broyeur à billes :
Mettre 1 bille d’acier par tube. Mettre les tubes dans les portoirs du broyeur (stockés à -50°C), en les équilibrant, et mettre 1 papier épais (stocké à -50°C) sous chaque couvercle de portoir pour amortir les chocs des tubes.
Broyer 1 min à 25 secousses.sec-1. Refroidir les portoirs et tubes 10 min à -80°C.
Re-broyer 1 min à 25 secousses.sec-1.
Remettre rapidement les échantillons dans de l’azote liquide.

2. Ajouter 800 µl de TRIzol. Vortexer quelques secondes.
Attention : vérifier que les tubes ne sont pas fendus. Si les tubes sont fendus, transférer rapidement dans de nouveaux tubes (après ajout du TRIzol).
Rq : pour les tissus > 100 mg MF, mettre 8 µl TRIzol / mgMF. Pour les étapes suivantes, ajuster les volumes des différents réactifs en conséquence.

3. Incuber 5 min à température ambiante sur branlicoteur.

4. Ajouter 160 µl de chloroforme / alcool isoamylique (24/1), vortexer 15 sec et incuber 3 min à température ambiante sur branlicoteur.

5. Centrifuger 10 min à 14000 rpm., à 4°C.

6. Numéroter une nouvelle série de tubes de 1,5 ml. Déposer, dans ces tubes, 35 µg de glycogène (1 µl d’une solution à 35 µg.µl-1. Protocole de départ : 10 µg de glycogène, au lieu des 35 µg).
Rq : le glycogène n’est pas nécessaire pour les échantillons > 50 mg MF.

7. Transférer la phase aqueuse (phase supérieure, env. 450 µl) dans les nouveaux tubes. Jeter les tubes avec les billes.

8. Ajouter 400 µl d’isopropanol, mélanger par retournements et incuber 10 min à température ambiante.
Rq : l’incubation peut être plus longue, à 4°C (pause déjeuner,…).

9. Centrifuger 15 min à 14000 rpm., à 4°C.

10. Vider le surnageant (verser si possible).

11. Lavage : ajouter 800 µl d’éthanol 75% conservé à -20°C. Mélanger par retournements.

12. Centrifuger 10 min à 12000 rpm, à 4°C.

13. Vider le surnageant (verser si possible). Retourner les tubes sur un sopalin pour éliminer les gouttes. Sécher le culot sous vide de 5 à 10 minutes (attention de ne pas trop sécher le culot car il risque d’être trop difficile à resuspendre si trop sec).
Rq : à partir de cette étape, utiliser des cônes à fitres.

14. Reprendre le culot dans 87,5 µl d’H2O DEPC. Mettre les tubes sur de la glace. Re-suspendre en agitant à la pipette. Si nécessaire, incuber 5 min à 60°C et re-suspendre à nouveau à la pipette.

DNase et purification des ARNs

(Thomas, juin 2004)

Matériel :
Qiagen « RNase-Free DNase Set (50) » (ref. 79254)
Qiagen « RNeasy MinElute Cleanup Kit (50) » (ref. 74204)

Préparation avant la première utilisation du kit :
DNase : Dissoudre la DNase (1500 U) dans 550 µl H2O RNase-free. Aliquoter par 10 µl. Stocker à -20°C (9 mois).
Buffer RPE : Ajouter 44 ml d’éthanol 100% au buffer RPE concentré (rq : ne pas oublier de cocher la case « ethanol added » sur la bouteille).

Rq : toute cette étape se fait à température ambiante (ne pas mettre dans la glace).

Protocole :
1. DNase :
Rajouter aux 87,5 µl d’ARN :

	buffer RDD	10 µl
	DNase I	2,5 µl

Incuber 10 min à température ambiante

2. Fixation des ARNs à la colonne :
Ajouter 350µl de buffer RLT. Mélanger.
Ajouter 250 µl d’éthanol 100%, mélanger à la pipette et déposer immédiatement (en 3 fois) sur colonne.
Centrifuger 15 secondes à vitesse max, température ambiante (centri de paillasse).
Transférer les colonnes sur de nouveaux tubes 2 ml (jeter les anciens tubes).

3. 1er lavage :
Ajouter 500 µl de buffer RPE sur les colonnes.
Centrifuger 15 secondes à vitesse max, température ambiante (centri de paillasse).
Vider les tubes et remettre les colonnes sur les mêmes tubes.

4. 2ème lavage :
Ajouter 500 µl d’éthanol 80% sur les colonnes.
Centrifuger 2 minutes à vitesse max, température ambiante (centri de paillasse).
Transférer les colonnes sur de nouveaux tubes 2 ml (jeter les anciens tubes).

5. Séchage :
Centrifuger 5 minutes à vitesse max, température ambiante (centri de paillasse), sans fermer les colonnes (placer les bouchons dans le sens inverse de la rotation du rotor).
Transférer les colonnes sur de nouveaux tubes 1,5 ml (jeter les anciens tubes).

6. Elution :
Ajouter 14 µl d’H2O RNase-free au centre des colonnes.
Centrifuger 1 minute à vitesse max, température ambiante (centri de paillasse).
Rq : on obtient 12 µl d’ARN (volume mort de 2 µl).

Vérification des ARNs

1. Dosage des ARNs :
Dilution des ARN pour dosage : 1 µl dans 100 µl final (H2O DEPC).
Mesurer DO260 et DO280 au spectro (Biorad, programme ARN) avec une micro-cuve à quartz.
Calculer DO260 / DO280, qui doit être compris entre 1,8 et 2.
Calculer la concentration d’ARNs : 1 unité DO260 = 40 µg/ml
(Attention : ne pas oublier la dilution dans les calculs !)

2. Vérification qualitative (et quantitative) des ARNs sur gel :
Mélange de dénaturation (conservé à -20°C) : (pour 30 dénaturations)

	Tp MOPS 5X	46 µl
	Formaldéhyde	80,5 µl
	Formamide	230 µl
	Bleu ARN 10X	46 µl
	BEt 10 mg.ml-1	1 µl

Décontaminer le matériel d’électrophorèse dans NaOH 0.1M SDS 0.1% 30 min. Rincer.
Faire un gel d’agarose 0,8% (ou 1%) non-dénaturant dans du TAE 1X (RNase free). Rajouter 50 µg de BEt (5 µl d’une solution à 10 mg.ml-1) par 100 ml le gel.
Mélanger dans un tube 1,5 µl :
   1 µl d’ARNs
   2 µl d’H2O DEPC
   11,7 µl mélange de dénaturation.
Incuber 15 min à 65°C puis refroidir rapidement dans la glace fondante.
Déposer les échantillons, ainsi qu’une échelle de poids moléculaire, sur le gel. Faire la migration à un voltage tel que l’intensité soit inférieure à 100 mA.
Observer et prendre une photo du gel sous UV.

3. Vérification de l’absence d’ADN :
On vérifie par PCR classique sur 1/20 de la préparation l’absence d’ADN génomique. Les oligonucléotides préconisés sont dans le tableau ci dessous. Ne pas oublier les témoins positifs et négatifs. Si des amplifications sont détectées dans les échantillons, reprendre l’étape de Dnase.

	Gene AGI	séquence	amplif sur cDNA	amplif sur ADN génom	Position
Forward APTR	At1g27450	5′-CGCTTCTTCTCGACACTGAG-3′	180pb	320pb	400pb du 3′

Reverse APTR		5′-CAGGTAGCTTCTTGGGCTTC-3′

Forward GAPDH	At3g26650	5′-CTGTCTTGCTCCCTTTGTCA-3′	184pb	269pb	350pb du 3′

Reverse GAPDH		5′-CACAGCTTTAGCTGCTCCTG-3′

Reverse transcription des ARNm

(Thomas, d’après Philippe Nacry Avril 2004)

Rq : Le programme « ANNRT » du thermocycleur chauffe à 72°C, descend à 20°C, fait une pause à 12°C (pour ajouter le mix), reste 2 h à 42°C puis 5 min à 4°C. Durant tout le programme, le couvercle du thermocycleur est à 105°C.

1. Dans un tube eppendorf de 500 µl (ou en rack PCR) :
Reprendre 4µg d’ARN totaux dans 11 µl final (H2O milliQ stérile).
Ajouter 2 µl d’oligo dT ancrés 10 µM (T(18)V) (20 pmol).

2. Transférer le tube dans le thermocycleur. Chauffer 5 min a 72°C puis refroidir de 1°C par 10 sec jusqu’à 20°C.

3. Rajouter : (préparer un mix pour l’ensemble des réactions)

	5X RT buffer	4 µl
	dNTP 10 mM	2 µl
	Reverse Transcriptase M-MLV RT Promega	1 µl

4. Incuber 1h30 min à 42°C dans le thermocycleur.

5. Après incubation ajouter 180 µl de T10E1 (TE) pour stopper la réaction.

6. Transférer chaque solution d’ADNc dans :
1 tube pour stockage (150 µl)
1 tube pour utilisation (50 µl)

7. Utiliser 1 µl de cette solution pour les analyses en RT.

Vérification de la qualité des ADNc :
On vérifie en PCR classique sur 1µl de la préparation la présence d’une amplification de taille attendue. Les oligonucléotides préconisés sont les mêmes qu’a l’étape (3). Ne pas oublier les témoins positifs et négatifs.

	Gene AGI	séquence	amplif sur cDNA	amplif sur ADN génom	Position
Forward APTR	At1g27450	5′-CGCTTCTTCTCGACACTGAG-3′	180pb	320pb	400pb du 3′

Reverse APTR		5′-CAGGTAGCTTCTTGGGCTTC-3′

Forward GAPDH	At3g26650	5′-CTGTCTTGCTCCCTTTGTCA-3′	184pb	269pb	350pb du 3′

Reverse GAPDH		5′-CACAGCTTTAGCTGCTCCTG-3′

Protocole réaction Q-PCR

(Thomas et Marc d’après Philippe et Gabriel, Juin 2004)

Réservation de la machine
http://calendar.yahoo.com/
Yahoo! ID : bpmpqpcr
mot de passe : jossia

LC préMix
Des tubes de réactifs 1a et 1b sont stockés dans le tiroir à enzyme à -20°C. Le LCMix (213 µl) est obtenu en mélangeant 1 tube neuf de réactif 1a (23.3 µl) avec 1 tube neuf de réactif 1b (190 µl). Stocker à l’abri de la lumière à 4°C < 2 semaines

Amorces
Les oligos sont en solution à 10 µM

Mix réactionnel

LC prémix	2	4	8	12	16	20	24	28	32	36	40	44	48	52	56	60	64	68	136	200	268
amorce 1	.5	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	34	50	67
amorce 2	.5	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	34	50	67
H2O	6	12	24	36	48	60	72	84	96	108	120	132	144	156	168	180	192	204	408	600	804
total	9	18	36	54	72	90	108	126	144	162	180	198	216	234	252	270	288	306	612	900	1206

Le mix peut être conservé < 2 semaines à l’abri de la lumière à 4°C.

Faire un témoin négatif en remplaçant le cDNA par de l’eau
Faire une gamme en utilisant l’ échantillon dont le signal attendu est le plus fort ; dilution 1, 1/10, 1/100, 1/1000
Déposer dans les capillaires avec des cônes effilés (1 carrousel = 32 capillaires max)
   1 µl ADNc (produit de la réaction de RT-PCR)
   9 µl de Mix réactionnel
   Les capillaires peuvent être conservés quelques heures avant la réaction

Run
1. Disposer les capillaires dans le carrousel du light cycler SANS FORCER (en cas de blocage nettoyer la loge du capillaire avec une petite brosse prévue à cet effet). Mettre le carrousel avec les capillaires dans son adaptateur (sigle roche vers le haut). Centrifuger (la centrifugeuse est programmée).

2. Disposer le carrousel dans le light cycler (il y a une encoche)

3. Fermer le couvercle

4. Ouvrir le logiciel light cycler3. Cliquer sur RUN. Le logiciel demande de faire un self test, si c’est la première utilisation cliquer OK (lors du test la paillasse doit rester immobile).
Cliquer sur open experimental file-PROTOCOLE-MARC

Les conditions de pCR sont :

	10 minutes à 95°C
	95°C 5 s
	62°C 7 s		45x
	72°C 8 s
	95°C 10 s
	73°C 30 s
	melting curve (73°C à 95°C pente de température de 0.05°C par seconde)
	refroidissement à 40°C 10 min

5. Cliquer sur EDIT SAMPLES
Indiquer le nombre d’échantillons
Cliquer sur DONE
Cliquer sur RUN
– pour les échantillons de gamme choisir « standart »
– pour le temoin négatif choisir « negative »
– pour les échantillons à analyser choisir « unknown ».
Cliquer sur DONE.
Une fenêtre de RUN s’affiche qui donne la fluo acquise au cours du temps.

Analyse des données
1. Data analysis-user-Admin-Data

Placer les cuseurs vert comme ça

Cliquer Température.
Cliquer melting curve.
Analyser les courbes.
Un pic par échantillon.
Fermer la fenêtre

Placer les cuseurs vert comme ça

Cycle-quantification
Fit point

Step 2 : noise bande

Cliquer sur

Afficher 0,5

Step 3

Cliquer sur

Afficher 1

Pour sauver les datas : Quantification-export standard curve (sur clef USB)