Fichier : clonage.doc
Personne référente : Jossia Boucherez
Les enzymes et les kits sont disponibles dans le congélateur Proméga et au magasin
PCR Dephosphorylation Extraction phénol-chlorophorme Phosphorylation Purification Ligation Transformation MiniExtraction Digestion1 MaxiExtraction Dosage Digestion2
Réaction de PCR
Précaution : utiliser des cônes de pipette à filtre
Avec GO Taq (Promega M3171)
| matrice : | 10 ng ADN, cDNA, RT |
| 10 µl tampon Taq pol 5 X | |
| 1 µl dNTP (10mM) | |
| amorces : | 1 µl des 2 oligos (10 µm) |
| 0.2 µl d’enzyme (taq ploymérase) | |
| H2O qsp 50 µl |
Programme couramment utilisé (master cycler eppendorf)
94°C 2 min puis 30°C
65°C 30 s
moins 1°C/Cycle
puis
72°C (30 s à 2 min, dépend de la taille de l’insert*)
GO TO 3 REPEAT 9
94°C 30 s
55°C 45 s
72°C (30 s à 2 min, dépend de la taille de l’insert*)
GO TO REPEAT 7 REPEAT 34
72°C 5 min
4°C 15 min
* durée d’élongation à 72°C : 30 s pour 500 pb, 1 min pour 1 kb, etc…
Avec pfu (Promega M7741)
| matrice : | 10 ng DNA |
| 3 µl tampon 10 X (pfu) | |
| 1 µl dNTP (10mM) | |
| amorces : | 3 µl des 2 oligos (10µM) |
| H20 qsp 30 µl |
Hot Start:
2 µl tampon 10 X
0.67 µl enzyme
17.33 µl H2O
Déphosphorylation d’un vecteur avec phosphatase alcaline (Alkaline phosphatase Calf Promega M1821) :
5 µl de tampon 10 X
H2 qsp 50 µl
Avec extrémités 5′ :
0.2 µl d’enzyme 30′ à 37°C
Puis rajout de 0.2 µl d’enzyme 30′ à 37°C
Avec extrémités 3′ et franches :
0.2 µl d’enzyme 15′ à 37°C puis 15′ à 56°C
Puis rajout de 0.2 µl d’enzyme, 15′ à 37°C, 15′ à 56°C
Ajouter 150 µl d’eau pour extraction au phénol/chloro
Extraction au phénol-chlorophorme :
– ajouter 200 µl de phénol-chlorophorme-alcool isoamylique (PCI V/V 24/24/1)
– mélanger, centrifuger. Changer de tube
– récupérer le surnageant et laver 2 fois avec CI
– précipiter l’ADN en ajoutant 440 µl d’EtOH absolu + 20 µl de NaAC 3M pH 5.2
– placer 1 h ou overnight à -20°C. Centrifuger 10 min, rincer avec 1 ml d’éthanol 70%
Pour 100 ml CI, 96 ml de chlorophorme, 4 ml d’alcool isoamylique
Phosphorylation d’un fragment (avec T4 polynucléotide kinase Promega M4101) :
5 µl tampon 10X
5 µl ATP 10 mM
1 µl T4 PNK
H2O qsp 39 µl
Phénol/Chloro/Précipitation
Resuspendre dans 20 µl de TE + bleu 10X pour purification sur gel
Purification de fragment d’ADN sur gel (Kit Promega A9281) :
– Faire migrer le produit d’amplification PCR sur un gel d’agarose (% d’agarose déterminé selon la taille des bandes à purifier), avec du tampon neuf (TAE 0.5 X), propre.
– Coloration au BET du gel : 1 µl pour 100 ml de gel
Manipuler les gels colorés au BET avec des gants nitrile. Jeter les gants dans la poubelle de déchets BET solides. Sécher les gels sous sorbonne et les jeter dans la poubelle spéciale BET.
– Découper la bande à l’aide d’une lame de scalpel, récupérer dans un tube eppendorf préalablement pesé, repeser et ajouter 10 µl de « Membrane Binding solution » par 10 mg de gel.
– Chauffer au bain marie à 50-65°C jusqu’à dissolution complète du gel.
– Transférer le mélange dans la « SV minicolumn » sur son « Collection Tube ». Incuber 1 min.
– Centrifuger 1 min (14000 rpm).
– Vider le « collection tube ».
– Ajouter 700 µl de « Membrane Wash Solution ». Centrifuger 1 min.
– Ajouter 500 µl de « Membrane Wash Solution ». Centrifuger 5 min.
– Vider le « collection tube ».
Transférer la « SV minicolumn » dans eppendorf 1.5 ml pour élution.
– Ajouter 15 µl de « Nuclease free water ». Centrifuger 1 min.
– Dosage sur gel :
1 µl (+ 9 µl H2O + 2 µl bleu de dépot 10X)
Ligation d’un vecteur et d’un insert :
Calcul (théorique) de la quantité d’insert :
Vecteur : 25 ng
Insert en ng : 25 ng X2 X taille de l’insert (en pb) divisé par la taille du vecteur (en pb)
2 µl de tampon ligase
0.5 µl de ligase (Promega réf M1801)
H2O qsp 20 µl
16°C overnight (bain-marie chambre froide)
Transformation dans bactéries (DH5α thermo-compétentes)
Le lendemain, faire décongeler doucement les bactéries compétentes dans la glace (voir protocole préparation bact thermo-compétentes)
– Ajouter 3 à 5 µl de ligation ou 50 ng de plasmide. Laisser 1/2 heure dans la glace.
– Faire un choc thermique : 45 sec à 42°C. Puis 2 min dans la glace.
– Ajouter 900 µl de LB (dans tube bactério).
– Faire pousser 1 h environ avec agitation à 37°C.
– Etaler sur boites avec antibiotique approprié.
– Ajouter si nécessaire 50 µl d’IPTG (0.1M) et 25 µl de X-Gal (40 mg/ml) par boîte selon plasmide utilisé (test blanc/bleu).
– incuber overnight dans l’étuve à 37°C.
Mini extraction ADN plasmidique (lyse alcaline) :
La veille, ensemencer les colonies dans 2 ml de milieu LB + antibiotique (tubes bactério).
– Transférer les cultures dans des eppendorfs de 1,5 ml.
– Centrifuger, 1 min, (vit max, room temp) pour récupérer les bactéries dans le culot.
– Enlever tout le surnageant.
Resuspendre dans 100 µl TEG (TRIS 25 mM, EDTA 10 mM, glucose 50 mM) + lysosyme (2 mg lysosyme/ml TEG).
– Ajouter 200 µl de SDS/NaOH (1% SDS, 200 µM NaOH), préparé extemporanément, mélanger en inversant les tubes.
– Ajouter 150 µl de K acétate 3M pH 4.8, mélanger.
– Placer à -20°C 5 minutes.
– Centrifuger 10 min.
– Récupérer le surnageant dans eppendorfs neufs contenant 900 µl d’éthanol absolu, bien mélanger par inversion des tubes.
– Centrifuger 10 min.
Enlever le surnageant.
– Rincer le culot avec 1 ml d’ETOH 70%.
– Sécher le culot à temp ambiante
– Reprendre le culot dans 20 µl d’H2O.
Prendre 2 µl pour la digestion.
Le SDS dénature les protéines bactériennes. Le NaOH renature l’ADN. Le Kacétate neutralise le mélange et permet à l’ADN plasmidique de se refermer. La plupart de l’ADN chromosomique, des protéines, du SDS complexé par le potassium précipite à la centrifugation. Pour neutraliser les RNA contaminants, on ajoute de la RNase A.
Digestion par enzyme de restriction pour vérification du clonage :
dans 15 µl (par prép):
1.5 µl de tampon approprié
0.3 µl d’enzyme
0.2 µl de RNase (10mg/ml ribonuclease A Sigma R-4642)
11 µl H2O
Digestion 1 h environ à 37°C.
Dépôt sur gel d’agarose environ 0.8%.
Tampon pour le gel et la migration : TAE 0.5 X
TAE 50X (pour 1 litre) :
242 g TRIS
37.2 g EDTA
57.1 ml d’acide acétique
Maxi-extraction d’ADN plasmidique :
Avec colonnes Nucleobond Macherey Nagel (ou Kit Promega A2492 et A7640 disponibles au magasin)
Faire pousser overnight 50 ml de culture dans pot copro.
– Récupérer dans falcon 50 ml et centrifuger 5 min. (Rotor swing 5000 g).
– Remettre le culot en suspension dans 4 ml de tampon S1.
– Ajouter 4 ml de tampon S2 , mélanger. Laisser incuber 5 min à t° ambiante.
– Ajouter 4 ml de tampon S3 (froid), mélanger.
– Incuber 5 min dans la glace. Centrifuger 15 min 5000 g.
– Verser le surnageant sur filtre papier.
– Equilibrer la colonne avec 2.5 ml de N2.
– Passer le surnageant sur colonne.
– Rincer 2 fois avec 5 ml de N3.
– Eluer la colonne avec 5 ml de N5 sur des tubes avec bouchon à vis.
– Ajouter 3.6 ml d’isopropanol froid.
– Centrifuger 20 min à 15000 g.
– Rincer avec 1 ml d’EtOH 70% et récupérer le culot dans un eppendorf.
– Centrifuger 5 min.
– Reprendre le culot entre 20 et 50 µl de TE.
Diluer l’ADN et le digérer par une enzyme permettant la linéarisation du plasmide. Evaluer la quantité par rapport à la bande de 1650 pb de l’échelle de poids moléculaire (1KB+ Fisher Scientific bioblock N3401M, disponible au magasin) qui correspond à 50 ng.
– 5 à 10 µg d’ADN
– 20 µl tampon
– 1.5 à 3 µl d’enzyme
– H2O qsp 200 µl
1 heure à 37°C, rajouter de l’enzyme, et encore 1 heure à 37°C.
Phénol/chloro, précipitation
PCI : Moitié phénol, moitié CI
CI : Pour 100 ml, 96 ml de chloroforme, 4 ml d’alcool isoamylique.