Fonction des protéines ROPGEF dans la signalisation cellulaire : interaction entre les signaux hydriques, hormonaux et pathogènes

 

Laboratoire d’accueil : Laboratoire de Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes (BPMP), Campus SupAgro, place Viala, Montpellier

Equipe d’accueil : Aquaporines

Responsable de stage : Alexandre Martinière (CR2-CNRS), alexandre.martiniere@cnrs.fr (04 99 61 20 21)

Poursuite en thèse : Oui

Gratification : Oui

CONTEXTE

Les plantes subissent un stress hydrique suite à de nombreuses contraintes environnementales, comme la sécheresse, la salinité des sols, une faible humidité de l’air ou même des variations de température. Afin de s’adapter à ces contraintes plus ou moins transitoire, les plantes peuvent ajuster leurs développements et/ou modifier leurs physiologies. Par exemple, elles peuvent réduire la durée de leur cycle de vie, ajuster le nombre de leurs feuilles par abscission, ou modifier l’architecture de leur système racinaire afin d’optimiser l’absorption d’eau (hydropatterning ou hydrotropism) (Robbins and Dinneny, 2015). Cependant de manière surprenante, au niveau cellulaire, les mécanismes moléculaires permettant la perception et la transduction du signal hydrique reste à l’heure actuelle inconnus.

Une des réponses rapide des cellules au stress hydrique est la production de message secondaire servant à la transduction du signal. En particulier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) ont été montrées comme agissant en amont de certaines réponses de la plante en relation avec leur homéostasie hydrique comme la régulation de la perméabilité hydrique racinaire, l’endocytose des aquaporines ou bien la stimulation de la biosynthèse d’osmoticum (Boursiac et al., 2005; Ben Rejeb et al., 2015; Martinière et al., 2019). Récemment au sein de l’équipe, nous avons d’une part caractérisé les enzymes impliquées dans la production de ROS en réponse à la contrainte hydrique, et d’autre part nous avons identifié une petite GTPase agissant comme un régulateur en amont (Martinière et al., 2019).

Les GTPase de la famille Rho, agissent comme des interrupteurs moléculaires qui permettent la transduction de signaux. Elles existent sous deux formes, soit active lorsqu’elles sont associées au GTP, soit inactive lorsqu’elles sont associées au GDP (Feiguelman et al., 2018). Nous avons montré que la présence de la protéine ROP6 sous sa forme active est nécessaire et suffisante pour activer la réponse hydrique (données non publiées). De plus, au niveau de la membrane plasmique ROP6 à la propriété de s’associer transitoirement avec les radeaux lipidiques de la membrane plasmique (Sorek et al., 2010; Platre et al., 2019). Nous avons montré que ces structures, qui sont connues dans le domaine animal comme étant des plateformes de signalisation, sont nécessaire et suffisante pour activer la signalisation hydrique. De plus, il est apparu que la formation de nanodomaine de la protéine ROP6 permettait de séquestrer les enzymes nécessaires à la production de ROS, tel que RBOHD et F. Ces résultats montrent que l’organisation des protéines dans la membrane plasmique, en particulier du complexe ROP6/RBOHD et F, est primordiale pour l’induction de la signalisation hydrique.

OBJECTIF

L’objectif de ce stage est de trouvé quels sont les mécanismes moléculaires de l’activation de ROP6 suite à une contrainte hydrique. Nous avons identifié ROPGEF14 comme un candidat intéressant, car d’une part ce gène code pour une guanine nucleotide exchange factor dont l’activité permet le passage de GDP à GTP des ROPs et d’autre part car deux allèles ko de ce gène montre une absence de production de ROS en réponse à la contrainte hydrique.

Dans un premier temps, il s’agira de confirmer le rôle des protéines ROPGEF14 dans l’accumulation de ROS et de démontrer son importance dans l’activation des réponses des plantes à la contraintes hydriques. Pour cela la lignée complémentée ropgef14.1xProROPGEF14:citr-ROPGEF14 a été générée. Ensuite, le patron d’expression et la localisation de ROPGEF14 sera étudié. En particulier, il sera intéressant de tester sa potentiel association avec les nanodomaines de ROP6 par microscopie TIRF. Les propriétés de diffusion et de clustering de ROPGEF14 seront également quantifiées par imagerie en molécules uniques (sptPALM) (Hosy et al., 2015). Enfin, le rôle de ROPGEF14 dans la formation des nanodomaines de ROP6 sera tester. Le matériel génétique nécessaire pour ces expériences sont disponibles dans le laboratoire (oxEOS-ROPGEF14, oxGFP-ROPGEF14 et ropgef14.1xGFP-ROP6).

Dans un deuxième temps, il sera possible de tester une potentielle interaction entre ROP6 et ROPGEF14 par FRET-FLIM. Ces données pourront être comparer à celle obtenue avec une forme dominant active de ROPGEF14 (domaine PRONE seul), ainsi que les formes constitutives actif ou dominant négative de ROP6.

La dernière partie du stage sera consacré à tester si les ROPGEFs sont responsables de la spécificité de la réponse au signal hydrique. Effectivement, ROP6 est impliqué dans de nombreuses voix de signalisation (Platre et al., 2019) (auxine, ABA et PAMPs). Il s’agira de déterminer si ROPGEF14 ou d’autre isoformes ROPGEFs sont nécessaires pour la transduction de ces signaux. Pour cela, des mutants simples, quadruples et quintuples pour les isoformes de ROPGEF exprimées dans la racine pourront être testés.

RESULTATS ATTENDUS

Les travaux de ce stage permettront d’une part de tester l’implication de ROPGEF dans la signalisation hydrique et d’autre part de déterminer comment les domaines de ROP6 dans la membrane peuvent contrôler la spécificité des signaux cellulaire des plantes.

TECHNIQUES UTILISEES

Biologie cellulaire : imagerie ROS, microscopie in vivo confocale, microscopie TIRF et à super résolution (sptPALM), analyse d’image, FRET-FLIM

Génétique inverse et culture in vitro : génotypage, croisement et transformation génétique (via Agrobacterium)

Biologie moléculaire : clonage, PCR

REFERENCES

Ben Rejeb K, Lefebvre-De Vos D, Le Disquet I, Leprince A-S, Bordenave M, Maldiney R, Jdey A, Abdelly C, Savouré A (2015) Hydrogen peroxide produced by NADPH oxidases increases proline accumulation during salt or mannitol stress in Arabidopsis thaliana. New Phytol 208: 1138–1148

Boursiac Y, Chen S, Luu D-T, Sorieul M, van den Dries N, Maurel C (2005) Early effects of salinity on water transport in Arabidopsis roots. Molecular and cellular features of aquaporin expression. Plant Physiol 139: 790–805

Feiguelman G, Fu Y, Yalovsky S (2018) ROP GTPases Structure-Function and Signaling Pathways. Plant Physiol 176: 57–79

Hosy E, Martinière A, Choquet D, Maurel C, Luu D-T (2015) Super-resolved and dynamic imaging of membrane proteins in plant cells reveal contrasting kinetic profiles and multiple confinement mechanisms. Mol Plant 8: 339–342

Martinière A, Fiche JB, Smokvarska M, Mari S, Alcon C, Dumont X, Hematy K, Jaillais Y, Nollmann M, Maurel C (2019) Osmotic Stress Activates Two Reactive Oxygen Species Pathways with Distinct Effects on Protein Nanodomains and Diffusion. Plant Physiol 179: 1581–1593

Platre MP, Bayle V, Armengot L, Bareille J, Marquès-Bueno MDM, Creff A, Maneta-Peyret L, Fiche J-B, Nollmann M, Miège C, et al. (2019) Developmental control of plant Rho GTPase nano-organization by the lipid phosphatidylserine. Science 364: 57–62

Robbins NE, Dinneny JR (2015) The divining root: moisture-driven responses of roots at the micro- and macro-scale. J Exp Bot 66: 2145–2154

Sorek N, Segev O, Gutman O, Bar E, Richter S, Poraty L, Hirsch JA, Henis YI, Lewinsohn E, Jürgens G, et al. (2010) An S-acylation switch of conserved G domain cysteines is required for polarity signaling by ROP GTPases. Curr Biol CB 20: 914–920