Expression hétérologue et électrophysiologie végétale

B&PMP héberge une plateforme d’expression hétérologue et d’électrophysiologie végétale (EHEV-BPMP) au sein de l’Institut de Biologie Intégrative des Plantes unique en France.

Expression hétérologue

     La plateforme offre des possibilités d’expression hétérologue dans différents contextes :

  • Lignées cellulaires animales (COS, CHO, Sf9) à la culture desquelles est dédiée une salle blanche disposant, avec son sas technique, d’un équipement complet (surpression par air filtré, climatisation autonome, deux incubateurs à CO2, deux hottes stériles, centrifugeuse réfrigérée, etc.),
  • Ovocytes de Xénope, avec une pièce dédiée au prélèvement chirurgical des ovocytes et à leur incubation à 20°C et les équipements nécessaires à leur micro-injection par du matériel génétique (3 postes de micro-injection disponibles),
  • Cellules végétales (expression transitoire par « floral dip », « PEG » et « biolistique »).

Ces systèmes d’expression sont utilisés à BPMP, principalement pour la caractérisation de protéines membranaires impliquées dans le transport. S’ils offrent la possibilité d’étudier les propriétés fonctionnelles de ces protéines par différents moyens disponibles à BPMP (spectrométrie 15N pour les transporteurs d’azote/acides aminés, utilisation de traceurs radiomarqués ([3H]-ABA/[3H]-IAA) pour les transporteurs d’hormones,  gonflement osmotique de protoplastes ou ovocytes pour les aquaporines, …) et sont à ce titre utilisés par pratiquement toutes les équipes de BPMP, ces systèmes d’expression hétérologue sont plus particulièrement exploités dans la seconde composante de la plateforme dédiée aux enregistrements électrophysiologiques.
 

Electrophysiologie

La plateforme regroupe huit postes d’enregistrement dédiés à des applications spécifiques.

Poste Patch-clamp Laser

Un premier poste de patch-clamp (Patch-clamp Laser) est équipé d’un laser pour la microdissection de la paroi pecto-cellulosique et permet des enregistrements en patch-clamp in situ sur les poils racinaires (unique en France).
 

Un deuxième poste de patch-clamp (Patch-clamp Imagerie) est équipé d’un système d’imagerie de la fluorescence (monochomateur + source conventionnelle avec filtres, caméra EMCCD ultra-sensible refroidie) et permet le patch-clamp couplé à l’imagerie par fluorescence (GFP) ou bioluminescence (sonde calcique aequorine).

Ces deux postes sont également disponibles pour des enregistrements en patch-clamp conventionnels, sur protoplaste, cellule animale en culture ou ovocyte de Xénope.
 

Poste ovocyte (TEVC)

Les six autres postes sont installés dans une grande salle attenante à l’atelier de fabrication des microélectrodes. Deux postes au design identique (Poste Ovocyte 1 et Poste Ovocyte 2) sont dédiés aux enregistrements des forts courants souvent observés dans les ovocytes sur-exprimant des canaux sur ovocyte de Xénope (voltage-clamp à deux électrodes). L’ergonomie de ces deux postes a été optimisée pour en faciliter l’accès à des opérateurs débutants (quelques jours de formation seulement sont nécessaires).
 

Le troisième poste de patch-clamp (Poste single channel) de la plateforme a été optimisé pour les enregistrements de courants à travers des canaux ioniques isolés (« single channel recording »).
 

Un autre poste (Poste Signalisation) est dédié aux enregistrements sur système foliaire de plantes entières (Arabidopsis ou plantules de graminées). Il permet l’enregistrement extracellulaire de signaux électriques propagés en réponse à divers stimuli. L’équipement de ce poste permet l’acquisition en différentiel sur 40 canaux différents (électrodes extra-cellulaires), pour enregistrer les signaux électriques (de type potentiel d’action) et cartographier leur propagation dans le système foliaire.
 

Poste Racine

Un poste (Poste Racine)  permet les enregistrements intra et extra-cellulaires à l’aide de  microélectrodes à potentiel et/ou de microélectrodes ioniques spécifiques (H+, K+, NO3, …). Le design de ce poste est optimisé pour les racines et permet, par exemple la mesure simultanée de la différence de potentiel et du flux ionique transmembranaires.
 

Le dernier poste (en construction) sera équipé d’un microscope motorisé spécifique (x320 stéréo et x1000 mono) et permettra les enregistrements intracellulaires de potentiel de membrane ou de concentration ionique.

Modalités d'accès
Prendre contact avec :

Responsable scientifique Anne-Aliénor Véry, CR CNRS
04/61/99/25/74, anne-alienor.very@supagro.fr

Ingénieur en charge de la plateforme Claire Corratgé-Faillie, IR CNRS
04/67/61/27/01  claire.corratge-faillie@supagro.fr

Les principaux protocoles pour la préparation des solutions de perfusion, les réglages des étireuses, la programmation des séquences de voltage-clamp sont consignés et accessibles ci-dessous dans l’onglet Protocoles. La gestion des principaux consommables est assurée par la plateforme et la maintenance des matériels est financée sur une ligne spécifique du budget de l’UMR BPMP. L’agenda de la plateforme (réservation des postes d’enregistrement) est accessible par une application en ligne sur l’Intranet de BPMP (Pour les scientifiques extérieurs, merci de prendre contact avec les responsables).
Un comité des usagers de la plateforme est réuni annuellement par les responsables scientifiques.

Personnels / Organigramme


Anne-Aliénor Véry
Responsable scientifique
Téléphone : 04 99 61 25 74
Bureau : 150


Claire Corratgé-Faillie
Responsable technique
Téléphone : 04 99 61 27 01
Bureau : 146

Expertise
  • Expression en système hétérologue de systèmes de transport (canaux, transporteurs, aquaporines)
  • Caractérisation fonctionnelle  :
    -TEVC
    -Patch-clamp
    -BLM
    -Potentiel de membrane
Formations
Actualités
Publications

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Krouk G, Lacombe B, Bielach A, Perrine-Walker F, Malinska K, Mounier E, Hoyerová K, Tillard P, Leon S, Ljung K, Zažímalová E, Benková E, Nacry P, Gojon A (2010) Nitrate-regulated auxin transport by NRT1.1 defines a mechanism for nutrient sensing in plants. Dev. Cell, 18(6):927-937

Cuéllar T, Pascaud F, Verdeil J-L, Torregrosa L, Adam-Blondon A-F, Thibaud J-B, Sentenac H, Gaillard I (2010) A Grapevine Shaker inward K+ channel activated by calcineurin B-like calcium sensor 1 – protein kinase CIPK23 network is expressed in grape berries under drought stress conditions. Plant J., 61(1):58-69

Qualité
Accès restreint / réservé
Protocoles

Les protocoles de la plateforme seront disponibles prochainement.

MISTRAL 2018

2-13 juillet 2018 – Montpellier International School on ion and water TRAnsport in PLant – BPMP, Montpellier – Organisateurs : Alain Gojon & Anne-Aliénor Véry

E2M 2018

26-30 mars 2018 (théorie) & 14-18 mai 2018 (pratique) – Ecole d’électrophysiologie de Montpellier – Contact BPMP : Hervé Sentenac