Les techniques de microscopie à super-résolution ont repoussé les limites de l’imagerie optique à des résolutions spatiales sans précédent. Cependant, l’une des frontières de la nanoscopie est son application à des organismes vivants intacts. Nous décrivons ici la mise en œuvre et l’application de la microscopie de localisation photoactivée à suivi de particules uniques à super-résolution (sptPALM) pour sonder la dynamique monomoléculaire des protéines membranaires dans les racines vivantes de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Nous discutons d’abord des avantages et des limites de sptPALM pour l’étude des propriétés de diffusion des protéines membranaires et nous comparons cela à la récupération de la fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et à la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Nous décrivons les détails techniques de la manipulation et de l’imagerie des échantillons pour sptPALM, avec un accent particulier sur la spécificité de l’imagerie des cellules végétales, comme leurs parois cellulaires épaisses ou leur haut degré d’autofluorescence. Nous fournissons ensuite un guide pratique de la collecte des données à l’analyse des images. En particulier, nous présentons notre logiciel sptPALM_viewer et décrivons comment l’installer et l’utiliser pour analyser les expériences sptPALM. Enfin, nous présentons un pipeline d’analyse statistique R pour analyser et comparer les expériences sptPALM. Dans l’ensemble, ce protocole devrait permettre aux chercheurs sur les plantes d’effectuer des sptPALM en utilisant un protocole reproductible étalonné. En routine, la procédure prend 3-4 h d’imagerie suivie de 3-4 j de traitement d’image et d’analyse de données.

Bayle V*, Fiche J-B*, Burny C, Platre MP, Nollmann M, Martinière A✉, Jaillais Y✉ (2021) Single-particle tracking photoactivated localization microscopy of membrane proteins in living plant tissues. Nat. Protoc., (in press)