souris:
|
séquences fortement répétées moyennement répétées uniques |
pourcentage 12 % 21 % 67 % |
taille environ 200 pb environ 2 e+5 pb environ 4 e+9 pb |
nombre de copies par génome 3,6 e+6 6300 1 |
La taille du génome est d'environ 6 e+9 pb
Les tables officielles donnent 3 e+9 pb, l'estimation précédente est donc est relativement bonne.
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5- Hybridation moléculaire de type Southern
hybridation: Texpérience = 42šCrinçage: Texpérience = 65šC
Le rinçage est plus "stringent": les appariements non spécifiques sont éliminés.
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6- Détermination d'amorces pour l'Amplification spécifique de séquence.
Par exemple:5'- TAGGTGACACTATAGAATAC -3'
5'- CCGGAAGCTTGGGCTGCAGG -3'
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7- Détermination de la taille optimale des amorces
a- P = (1/4)^n (1/4 puissance n)b- N = 2PC = (1/4)^n.2C
c- taille minimale de l'amorce = LOG(2C) / LOG(4)
|
organisme E. coli levure drosophile mammifères |
complexité du génome (C) 4 e+6 pb 1,4 e+7 pb 1,05 e+8 pb 1,8 e+9 pb |
Taille minimale de l'amorce 12 pb 13 pb 14 pb 16 pb |
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8- Amplification spécifique de séquence (PCR)
a- Les amorces doivent faire au moins 20 nucléotides (cf. exercice 7)séquences possibles:
5'- AACTGTGACTGCTTGCAAGG -3' (449-468)
5'- GAACACCGAACTCATCGAGG -3' (1483-1464)
b- Tm = 60šC et Tm = 62šC respectivement
c- par exemple:
94 šC 1 mn, 56šC 1 mn, puis 72šC 3 mn
d- 29 cycles à partir de 10 ng
24 cycles à partir de 500 ng.
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9- Amplification d'un microsatellite.
a- On cherche à amplifier la totalité du microsatellite. Pour deux individus ayant des nombres de répétitions CA différentes, les tailles des fragments amplifiés seront différentes, ce qui pourra être mis en évidence par simple électrophorèse. La technique d'électrophorèse devra toutefois permettre de discriminer des fragments d'ADN dont les longueurs ne diffèrent que de 2 paires de bases (gel d'acrylamide...)b- Il faut impérativement réaliser les amorces à partir des séquences flanquantes du microsatellite, séquences qui sont uniques dans le génome. On a ainsi une amplification spécifique du microsatellite considéré. Exemple de séquences d'amorces:
5'- GTGGTGTGCGATGAACATGG -3' (140-159)
5'- CCAATTGTTACCAGCATAGG -3' (376-357)
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10- Clonage et hybridation moléculaire de type Southern
a-
b-
c- A un des deux fragments Hind III de 3,5 kb ainsi qu'aux fragments Pvu II de 2 et 2,5 kb.
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11- Clonage et analyse de l'ADN recombinant
a- Préparation de l'insert: Extraction d'ADN génomique de souris. Digestion partielle de cet ADN par l'enzyme de restriction Eco RI, de manière à générer des fragments de 5 à 10 kb. Electrophorèse préparative pour purifier sur gel les fragments de 5 à 10 kb.Préparation du vecteur: Digestion complète de pBR330 par Eco RI. Déphosphorylation des extrémités.
Clonage: ligature des inserts et des vecteurs. Transformation de cellules d'E. coli. Recommencer les étapes précédentes jusqu'à avoir 10 e+6 colonies transformées indépendantes.
Sélection: sélection des colonies transformées sur milieu contenant de la streptomycine. Pour estimer le taux de colonies qui ont reçu un plasmide contenant de l'ADN génomique de souris, repiquage d'environ 500 colonies sur milieu contenant de l'ampicilline: seule les colonies qui ont reçu un plasmide ne contenant pas d'ADN génomique de souris poussent.
Sélection des clones contenant l'homologue du gène M du b¦uf: transfert des 10 e+6 colonies sur filtre et hybridation moléculaire de type Southern avec la sonde constituée du gène M de b¦uf (technique dite de "l'hybridation sur colonies").
b-
c- Les fragments de 2,5 et de 3,5 kb.
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12- Analyse par RFLP
Matrice de similarité:
Dendrogramme:
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13- Recherche de polymorphisme RFLP
a- La température de fusion pour le duplex formé par les gènes NPQ de Plaisant et NPQ de Express dans les conditions de l'hybridation est de 58šC. On réalise donc l'hybridation autour de 35šC.La température de fusion pour le duplex formé par les gènes NPQ de Plaisant et NPQ de Express dans les conditions du dernier rinçage est de 61šC. On réalise donc le dernier rinçage autour de 56šC.
b-
Le marqueur RFLP à retenir est le couple [enzyme de restriction: Hind III - sonde: fragment Eco RI de 2 kb du gène NPQ].
c- * Insertion dans le fragment Hind III de Express, au delà du site Eco RI de droite.
* Mutation chez Express, donc disparition (et éventuellement délétion), du site Hind III présent chez Plaisant.
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14- Regulation génique
a-
b- Traduction déficiente, ou alors bien sûr, enzyme instable ou dégradée
c- Site Xho I supplémentaire chez l'individu 2 dû à une mutation ponctuelle.
2 est homozygote muté et 1 homozygote non muté.
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15- Cartes de restriction d'un ADNc et du clone génomique correspondant
a- (les longueurs de fragment sont exprimées en kb)
b-
c- Le gène possède un intron. Cet intron contient la totalité du fragment génomique de 3 kb.
d- Il s'hybridera au moins au fragment génomique de 2,2 kb et très probablement au fragment de 3,4 kb (sauf si l'intron est placé sur le site Taq I à quelques bases prèsŠ).
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16- Analyse de mutants
Il y a une grosse délétion de 3,3 kb.
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17- Diagnostic de l'anémie falciforme
La mutation provoque l'apparition d'un site de restriction Mst II.Détection de la mutation par RFLP avec comme marqueur RFLP le couple [enzyme: Mst II - sonde: partie codante du gène].
Autre méthode (AFLP): à partir de l'ADN génomique du patient, on amplifie un fragment d'ADN avec des amorces choisies de part et d'autre du site Mst II puis on digère le produit amplifié par l'enzyme Mst II.
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18- Diagnostic de la fibrose kystique
a- cf. exercice 17. marqueur RFLP = couple: [enzyme: Eco RI - sonde: gène].b- environ 1/4 (car crossing over possible mais très improbable), sauf s'il y a complémentation (possible mais très rare pour des mutations dans un même gène) auquel cas l'enfant n'aura pas la maladie.
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19- Sous-clonage
On réalise une digestion totale du plasmide portant l'ADN génomique par les enzymes de restriction Eco RI et Bgl II. On réalise une digestion totale de pBLUESCRIPT par les enzymes Eco RI etBam HI. Bgl II et Bam HI sont des enzymes qui libèrent des extrémités cohésives (donc compatibles). On mélange les produits de digestion des deux plasmides avec une ligase. On transforme ensuite des cellules d'E. coli avec le résultat de la ligature, puis on sélectionne les clones recombinants sur un milieu contenant de l'ampicilline. On extrait ensuite l'ADN plasmidique des clones obtenus pour vérifier qu'ils contiennent bien le plasmide recombinant désiré: cette vérification se fait en réalisant une carte de restriction des ADN extraits.
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20- Carte de restriction d'un fragment amplifié par PCR
Un fragment amplifié par PCR est linéaire. Les cartes possibles sont:
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33- Quantification de la présence d'OGM par PCR quantitative
a. lectine: pente = -3,53 ; efficacité = 92 %promoteur 35S: pente = -3,36 ; efficacité = 98 %
Efficacité un peu faible pour la lectine.
b. échantillon 1: lectine = 180000 pg ; promoteur 35S = 1880 pg (1,04 %)
échantillon 2: lectine = 21300 pg ; promoteur 35S = 1921 pg (9%)
Les deux lots de fèves doivent être étiquetés (seuil de 1% dépassé).
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34- Analyse de l'expression d'un transgène
a. Hybridation moléculaire de type northern. On pourrait imaginer utiliser la RT-PCR quantitative, mais c'est à l'heure actuelle encore une méthode trop "complexe" pour justifier son utilisation dans le contexte décrit.Pour la description des étapes, voir cours.
b. "Effet de position" qui "explique" les différences d'expression pour un même nombre d'insertions.
"Co-supression" qui "explique" l'extinction de l'expression des transgènes lorsque le nombre de copies est important.
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35- Mesure de la sensibilité de détection d'une puce à ADN
a. L'oligo-dT et le mélange de nonamères servent pour amorcer la réaction de reverse transcriptionb. L'efficacité de la reverse transcription n'est jamais de 100%. En outre, des ADNc partiels sont formés.
c. - D.O. = eLC ; donc la concentration en Cy3-dCTP est 0,67 pmol/microlitre.
La quantité Q de Cy3-dCTP est: Q = CV = 47 pmoles.
- La masse de Cy3-dCTP incorporée est: M = Q.324 = 0,015 microgrammes
La fréquence d'incorporation pour 1000 nucléotides est: F = 1000 M / 0,6 = 25. Il y a 25 Cy3-dCTP pour 1000 nucléotides.
- Fréquence d'incorporation non identique mais assez proche. Elle dépend de la séquence du gène.
d. - Nombre minimum de molécules d'ADNc: N = (100/20) 5.10^7 / F = 10^7 molécules
- Nombre total d'ADNc synthétisés: Ntot = 0,6.10^6 / 3.10^5 = 0,2.10^-11 moles soit 1,2.10^12 molécules
Abondance minimale pour la détection: Ab = N/Ntot # 8.10^-6
- Seuil de détection: S = 15000 Ab = 0,12 copie/cellule
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